Cathepsin D i rokowanie w raku piersi ad

Wybór do badania wymagał jedynie, aby ta informacja była dostępna i aby do testu pozostał wystarczający guz; poza tym był przypadkowy. Pobieranie i przechowywanie próbek nowotworowych piersi
Próbki raka piersi zamrożono w ciekłym azocie natychmiast po wycięciu i przechowywano w temperaturze -70 ° C. Tkanki sproszkowano w stanie zamrożonym i przechowywano w temperaturze -70 ° C aż do wymaganego testu. Próbki utrwalono formaliną, zatopiono w parafinie, wybarwiono heato- ksyliną-eozyną i zbadano mikroskopowo, aby potwierdzić obecność komórek nowotworowych. Wszystkie 397 próbek poddanych analizie pod kątem katepsyny D zawierało komórki nowotworowe.
Komórki MCF-7
Ludzkie komórki raka piersi MCF-7 hodowano w minimalnej pożywce podstawowej uzupełnionej 10 mM buforem HEPES, aminokwasami niestanowiącymi znaczenia, 2 mmol glutaminy na litr, 25 ug gentamycyny na mililitr, 6 ng insuliny bydlęcej na mililitr i 5 procentami cieląt. serum. Dodano wodorowęglan sodu (0,2%) w celu doprowadzenia pH do około 7,2. Komórki pozostawiono do wzrostu w 37 ° C w atmosferze zawierającej 5 procent dwutlenku węgla. Konfluentne komórki zebrano przez krótką inkubację z mM EDTA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, przemyto dwukrotnie solanką buforowaną fosforanem i przechowywano jako peletki komórkowe w -70 ° C aż do analizy.
Testy receptora steroidowego
Receptory estrogenu i receptory progesteronu w próbkach nowotworu testowano tak, jak to opisano gdzie indziej.7, 8 próbek nowotworu uznano za pozytywne pod względem receptora estrogenu, jeśli zawierały co najmniej 3 fmol miejsc wiązania specyficznego na miligram białka cytozolowego, a dodatni receptor progesteronu. jeśli zawierały co najmniej 5 fmoli na miligram białka cytozolowego.
Oznaczanie ploidii
Zawartość DNA w komórkach nowotworowych określono w sposób opisany wcześniej.9 Zawartość DNA została opisana jako diploidalna, jeśli po dodaniu ludzkich limfocytów krwi obwodowej do próbki guza, obserwowaliśmy nakładanie się pików G0 / G1. Zawartość DNA zdefiniowano jako aneuploid, jeśli dyskretne piki G0 / G1 można było potwierdzić po dodaniu limfocytów krwi obwodowej. Ponadto, szczyt aneuploidalny G0 / G1 musiał zawierać co najmniej 10 procent zebranych 50 000 zdarzeń próbki i mieć odpowiedni pik G2 + M.
Pomiar katepsyny D
Całkowite białka z próbek nowotworu lub peletek komórek ekstrahowano jak opisano w innym miejscu. 10 Krótko, około 10 mg proszku guza lub pastylki komórek traktowano 150 .l 5% dodecylosiarczanu sodu i gotowano przez pięć minut; ekstrakt białkowy zebrano przez odwirowanie przy 13000 xg przez dwie minuty. Nierozpuszczalny osad z proszku guza ponownie traktowano 150 .l 5% dodecylosiarczanu sodu. Pierwszy i drugi supernatant połączono, a stężenie białka oznaczono metodą kwasu bicynchoninowego
W warunkach denaturacji, w warunkach redukujących, 200 .g białek nowotworowych rozdzielono na 10% żelach poliakrylamidowych.12 Trzy stężenia (200 .g, 100 .g i 50 .g białka, odpowiadające 100, 50 i 25 arbitralnym jednostkom katepsyny D) stały ekstrakt dodecylosiarczanu sodu komórek MCF-7 był zawarty na każdym żelu jako wewnętrzny standard laboratoryjny
[patrz też: zakrzepica zatoki jamistej, olx miechów, floxal krople ]