Brak zakażenia HIV u dawców krwi z nieokreślonymi testami Western Blot na przeciwciała przeciwko HIV-1 czesc 4

Zastosowano dwie pary primerów gag, SK38 / 3920 i SK145 / 101, z ich odpowiednimi sondami, SK19 i SK102. Połączenie pary starterów SK38 / 39 z sondą SK19 może rutynowo wykrywać 10 kopii wirusa HIV-1 w .g ludzkiego łożyskowego DNA (odpowiednik 150 000 komórek) w naszym laboratorium; jego czułość wynosi co najmniej 97 procent w wykrywaniu sekwencji gag HIV-1 w DNA jednojądrzastych komórek krwi obwodowej od osób seropozytywnych w kierunku przeciwciała HIV-1 .21 Połączenie pary starterów SK145 / 101 z sondą SK102 ma podobną wrażliwość na wykrycie HIV-1 22 i jest również zdolna do wykrywania sekwencji gag wirusa HIV-2 (izolat ROD HIV-2). Jednak pomiar czułości diagnostycznej i swoistości tej kombinacji w wykrywaniu HIV-2 musi czekać na dostępność większej liczby próbek od osób z HIV-2. Testy reakcji łańcuchowej polimerazy przeprowadzono w następujący sposób: Próbki DNA (1 .g) z równoważnika 150 000 jednojądrzastych komórek krwi obwodowej od dawcy poddano 30 cyklom denaturacji (95 ° C, 30 sekund), ponowne zassanowanie (55 ° C, 30 sekund) i wydłużenie (72 ° C, 60 sekund) w obecności 50 pmoli każdej pary primerów HIV, 2,5 jednostki polimerazy Taq i 20 nmoli każdego trifosforanu deoksynukleotydu w całkowitej objętości 100 .l bufor reakcyjny (50 mM chlorek potasu, 10 mM TRIS kwas solny [pH 8,3] i 2,5 mM chlorek magnezu). Około 30 procent zamplifikowanego produktu poddano denaturacji przez 5 minut w temperaturze 95 ° C, a następnie poddano płynnej hybrydyzacji ze specyficznymi sondami znakowanymi 32Pend (250 000 cpm na reakcję, aktywność właściwa 3 do 5 .Ci na milimol) przez 15 minut w 55 ° C. DO. Połowę zhybrydyzowanego produktu następnie poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym przez jedną godzinę. Autoradiogramy żeli uzyskano po trzygodzinnym i nocnym wystawieniu na działanie filmu Kodak X-OMAT AR w temperaturze -70 ° C. Kontrole pozytywne składały się z próbek DNA od homoseksualnych mężczyzn pozytywnych na przeciwciała przeciwko HIV-1. Kontrole negatywne składały się z próbek DNA od osób zdrowych negatywnych na obecność przeciwciała HIV-1 i próbek odczynników bez DNA (w celu wykrycia zanieczyszczenia odczynnika przez sekwencje HIV) .23 Reakcja łańcuchowa polimerazy została również przeprowadzona na każdej próbce DNA przy użyciu para primerów (GH 26/27), która amplifikuje konserwatywny region HLA-DQ alfa, 24 w celu ustalenia, czy DNA w surowych lizatach komórkowych miał wystarczającą jakość do amplifikacji.
Co najmniej jedną porcję zamrożonych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej dla każdego dawcy analizowano w dwóch powtórzeniach dla każdej pary primerów HIV. W przypadku połowy dawców drugą podwielokrotność zamrożonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej analizowano w ten sam sposób. Próbka została uznana za HIV-pozytywną przez łańcuchową reakcję polimerazy, jeśli sekwencje HIV zostały wykryte przez obie pary starterów w dwóch powtórzeniach lub wykryte wielokrotnie przez co najmniej jedną parę starterów w dwóch powtórzeniach. Jeśli próbka była dodatnia w jednej z dwóch amplifikacji, przeprowadzono trzecią amplifikację w celu określenia pozytywności lub negatywności. Próbkę uznano za ujemną pod względem HIV w wyniku reakcji łańcuchowej polimerazy, jeśli nie wykryto wykrywalnych sekwencji HIV, gdy komórki analizowano w dwóch powtórzeniach dla każdej z dwóch par starterów.
Wyniki
Charakterystyka demograficzna i epidemiologiczna
Tabela 2
[patrz też: kulki gejszy do czego sa, choroba niemanna picka, mch obniżone ]