Analiza mutacji dla wykrywania heterozygotycznego i prenatalnej diagnostyki mukowiscydozy cd

Każdą probówkę następnie mieszano przez wirowanie i odwirowanie w celu doprowadzenia oleju mineralnego na powierzchnię. Podwielokrotności 100 ul doprowadzono do aparatu szczelinowego Schleicher i Schuell Minifold II (Keene, NH) (ostrożnie, aby uniknąć dostarczenia oleju mineralnego do studzienki) i przesączono pod próżnią zgodnie z instrukcjami producenta. DNA związano z nylonową membraną Zeta-Probe (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), którą najpierw moczono chwilowo we wrzącej wodzie dejonizowanej, a następnie moczono w 2X standardowym cytrynianie soli do momentu użycia (1X standardowy cytrynian soli to 0,15 M sodu chlorek i 15 mM cytrynian sodu, pH 7,0). Po wyjęciu z aparatu typu slot-blot , filtry wypalano przez dwie godziny w temperaturze 80 ° C w suszarce próżniowej. Prehybrydyzację przeprowadzono w 0,5 M roztworze fosforanu sodu (pH 7,2) i 7% dodecylosiarczanu sodu w 55 ° C przez co najmniej 30 minut. Oligonukleotyd specyficzny dla allelu do wykrywania normalnej sekwencji był 5 CACCAAAGATGATATTTTC-3 , a sekwencja specyficznego dla allelu wykrywania mutacji była 5 -AACACCAATGATATTTTCTT-3 .9 Sondy specyficzne dla alleli przygotowano przez etykietowanie. koniec 5 z . [32P] ATP i kinazą polinukleotydową, 19 po którym następuje oczyszczenie za pomocą wkładów NENSORB-20 (Dupont, Wilmington, Del.) zgodnie z instrukcjami producenta. Około 2 do 3X106 zliczeń Czerenkowa sondy dodano do 8 ml roztworu do hybrydyzacji dla pojedynczego filtra z urządzenia szczelinowego; kwoty zostały podwojone dla dwóch lub trzech filtrów. Hybrydyzację przeprowadzono w buforze prehybrydyzacyjnym z dodatkiem 25 .g sonikowanego DNA spermy z łososia na mililitr w 55 ° C przez co najmniej cztery godziny, ale zwykle przez noc. Filtry przepłukano w 500 ml 40 mM fosforanu sodu (pH 7,2) i 1% dodecylosiarczanu sodu przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie drugie płukanie w 500 ml przez 15 minut w 40 ° C. Filtry eksponowano na filmie Kodak XAR-5 (Rochester, NY) z ekranem intensyfikującym przez sześć do ośmiu godzin.
Obliczenia ryzyka
Ryzyko obliczono na podstawie równowagi Hardy ego-Weinberga dla p2 + 2pq + q2 = 1, gdzie p jest częstością dla prawidłowego allelu w locus mukowiscydozowym (0,98), q jest częstością dla allelu choroby (0,02), p2 jest częstotliwość nie-nośności, 2 pq to częstotliwość nosicieli, a q2 to częstotliwość pacjentów z mukowiscydozą. Jeśli d jest stopniem wykrycia mutacji mukowiscydozy, wówczas 2pqd jest częstotliwością nośników z pozytywnym testem mutacji, a 2 pq (1 – d) jest częstotliwością nośników z negatywnym testem mutacji. Alternatywnie, te prawdopodobieństwa można obliczyć za pomocą analizy bayesowskiej. Skorygowane ryzyko przewoźnika (ryzyko, że osoba z negatywnym wynikiem testu jest nosicielem) to częstotliwość przewoźników z ujemnym testem podzielona przez sumę tej częstotliwości i częstotliwość nieświadomych: Jeżeli jeden z rodziców ma pozytywny test mutacji i inny negatywny test, ryzyko mukowiscydozy u potomstwa wynosi 1/4 X skorygowanego ryzyka nosicielstwa. Jeśli oboje rodzice mają ujemny wynik testu na mutację, ryzyko mukowiscydozy u potomstwa wynosi 1/4 X (skorygowane ryzyko nosicielstwa) 2. W kontekście badań na obecność populacji u nosicieli, wskaźnik wykrywalności par zagrożonych jest równy d2, wskaźnik wykrycia jednego partnera dla pary narażonej na ryzyko wynosi 2 (1 – d), a stopa nieudanej identyfikacji partnerem dla zagrożonych par jest (1 – d) 2.
Wyniki
Rysunek 1
[więcej w: syndrom munchausena, cykl miesiączkowy śluz, cynaryna ]