Analiza mutacji dla wykrywania heterozygotycznego i prenatalnej diagnostyki mukowiscydozy ad

Północnoamerykańskie rodziny czarne, azjatyckie i bliskowschodnie zostały wyłączone z analiz. Rodzice i chore dziecko badano tylko wtedy, gdy rozpoznanie mukowiscydozy spełniało standardowe kryteria.1 Analiza DNA
Rycina 2. Rycina 2. Analiza mutacji u rodzin z historią torbielowatego zwłóknienia dla diagnostyki prenatalnej i wykrywania heterozygotycznego. Symbole rodowodu są takie, jak na Rysunku 1, z wyjątkiem tego, że diamenty oznaczają próbki płodu, a otwarte symbole nie są nośnikami lub członkami, których genotyp był niepewny. Cięcia oznaczają zmarłych członków rodziny. Haplotypy przedstawiono jak na Figurze 1, ale dane alleli przedstawiono dla XV-2c, KM-19 i polimorfizm w locus D7S8 (JGP) jako liczby poniżej symboli rodowodowych. Próbki bez DNA dodanego do reakcji łańcuchowej polimerazy są oznaczone przez X, a inne ścieżki, w których nie ma sygnału dla oligonukleotydu specyficznego dla allelu, są przypadkami, w których próbka DNA nie była dostępna od członka rodziny w rodowodzie.
Polimorfizmy restrykcyjno-fragmentacyjne określono dla sond XV-2c i KM-19, jak opisano poprzednio, i skonstruowano haplotypy.15 Dane przedstawiono również dla polimorfizmu PstI w locus D7S8, 18 oznaczono JGP na Figurze 2. Nieobecność Miejsce restrykcyjne-enzym dla każdego polimorfizmu jest wskazane jako allel i obecność miejsca jako 2 allelu. Haplotypy dla (XV-2c) – (KM-19) są następujące: A to 1-1, B to 1-2, C to 2-1, a D to 2-2.15
Genomowy DNA z pełnej krwi zawierający EDTA jako antykoagulant wytworzono przez zmieszanie go z równą objętością buforu do lizy (0,32 M sacharoza, 10 mM TRIS kwas solny [pH 7,5], 5 mM chlorek magnezu i procent Triton X-100 ). Jądrowy leukocytowy osad przemyto w buforze do lizy, a następnie poddano obróbce w celu przygotowania DNA. Peletki leukocytów, bezpośrednie próbki kosmówkowo-kosmków i hodowane peletki komórek zawieszono w roztworze proteinazy ABI K (Applied Biosystems, Foster City, CA), a następnie poddano obróbce ręcznej lub za pomocą ekstraktora kwasu nukleinowego ABI do ekstrakcji fenolem i strącania etanolem za pomocą użycie odczynników ABI i protokołu. DNA poddano amplifikacji zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA) z wyjątkiem tego, że zastosowano niższe stężenie polimerazy Taq. Każda 50-.l mieszaniny reakcyjnej zawierała 50 mM chlorku potasu, 10 mM kwasu TRIS-solnego (pH 7,8), 1,5 mM chlorku magnezu, 0,01 procent (wag./wag.) Żelatyny, 200 .M każdego trifosforanu deoksynukleotydu, 1,0 .M każdego startera oligonukleotydowego .g genomowego DNA i 1,25 jednostki polimerazy Taq. Do każdej reakcji dodano dwie krople oleju mineralnego.
Sekwencjami amplifikacji były 5 GTTGGCATGCTTTGATGACGCTTC-3 i 5 GTTTTCCTGGATTATGCCTGGGCAC-3 .9 Poprawną sekwencją dla drugiego startera powinno być 5 GTTTTCCTGGATTATGCCTGGCAC-3 .9. Amplifikację DNA przeprowadzono dla 25 lub 30 cykli; każdy cykl obejmował minutę denaturacji w 94 ° C, 30 sekund wyżarzania w 53 ° C i 2 minuty polimeryzacji w 72 ° C. Po amplifikacji do probówki mikrowirówki dodano 350 .l roztworu składającego się z 0,4 N wodorotlenku sodu, 25 mM EDTA i 0,01% błękitu bromofenolowego.
[patrz też: przetoka ślinowa, nitki grzybni w moczu, olx kedzierzyn kozle ]